很多老师使用瑞士insphero 的3D悬滴培养板获得3D微组织后，要提取RNA进行荧光定量PCR。下面这篇文章就是介绍如何提取insphero 3D微组织中的RNA:
使用Promega ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System提取三维（3D）微组织的RNA
Introduction介绍
基于细胞的药物开发和毒理学的多项分析，从培养细胞中提取高质量的RNA是非常重要的。一些应用如实时荧光定量PCR或微阵列分析的前提都是需RNA提取步骤。下面介绍的是从很小的微组织（约1000个细胞）中提取总RNA的protocol(ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System, promega)。
若想使用自动化RNA提取方法：可使用Promega的Maxwell 16 System。
Summary概述
从3D Insight 人肝脏微组织中提取RNA（ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System）。提取的RNA样本用QuantiFluor RNA system，Agilent 2100 Bioanalyzer，GoTaq 1-Step RT-qPCR System进行分析。
Materials材料
3D Insight Microtissues in GravityTRAP（Insphero）
1×PBS，含钙离子和镁离子
ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System（Promega Z6110）
Quantus Fluorometer（Promega E6150）
QuantiFluor RNA system(Promega E3310)
Procedure操作流程
一、微组织的准备
1.轻柔的吸除GraityTRAP板中的培养基，用70ul的1×PBS洗涤微组织2次，如下图Figure 1:
Figure 1: Pipette tip positioning during aspiration and addition of PBS
注：轻柔、缓慢洗涤微组织（<30ul/秒）
2.转移微组织，1000ul吸头垂直覆盖GraityTRAP板孔的底端，吸头尖端要与孔底部紧密接触，如Figure 2，将微组织吸出（约50ul）转移到1.5ml离心管中，避免吸入气泡（避免微组织损失）。
Figure 2: Microtissue harvest from GravityTRAP plate using a 1000ul pipette tip
3. 4000g离心1min，去除PBS，直接作为RNA提取的样本
二、RNA提取—ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System
1.直接加250ul LBA+TG buffer到样本中
2.漩涡震荡10秒，用吸头吹打10次，裂解微组织。如想更完全裂解，可使用掌上均质器5-10秒
3.再加85ul的isopropanol(异丙醇)，漩涡震荡5秒混合均匀
4.再参照ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System的手册进行结合和洗脱等步骤
5.用30ul水洗提RNA后，冰上放置
6.RNA浓度和产量用QuantiFluor RNA system和Quantus Fluorometer检测
Typical Results结果
使用ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System提取3D InSight人肝脏微组织中的RNA，结果见Figure 3.
Figure 3：A-RNAs were isolated from either 1，2，4，or 8 microtissues. Yields were determined using the QuantiFluor RNA system with the Quantus Fluorometer and the RNA 6000 Pico kit. All values are greater than 9 indicating high quality RNA.
B-HPRT specific primers were used with the GoTaq 1-Step RT-qPCR System to show amplifiability of the isolated RNAs.
C-RNAs were isolated from single microtissues to compare the average yield from one microtissue using this purification system.The line represents the average yield(n=6).
原文章链接：http://www.qbioscience.com/FileUPLoad/DownLoadFile/635659149543906250.pdf
Insphero 三维细胞培养产品链接：http://www.qbioscience.com/products_T304.html
|
