引言
在细胞和组织培养领域，从上世纪70年代起二维（2D）培养的局限性和三维（3D）培养的优点引来诸多关注，越来越多的研究希望将细胞从平面环境中转变到3D空间来。当前，虽然对基于细胞的效应研究和毒性测试中，制药工业如今最常用的依旧是2D方式，3D培养技术已在学术研究中被广泛应用。随着在生物相关性，通量，产出量等方面的改进，伴随3D培养成本的降低，3D培养在再生医学，基础研究和药物研发中的应用将越来越广泛，一场细胞由2D培养走向3D的变革正在发生。
2D细胞培养的局限性与3D培养的优势
细胞增殖，分化和代谢等生理活动都严重受到微环境的影响。当前细胞生物学研究大多还是在二维平面培养进行，这种平面培养、生长方式与机体内立体环境差别很大，导致细胞形态、分化、细胞与基质间的相互作用以及细胞与细胞间的相互作用与体内生理条件下细胞的行为存在明显差异。2D和3D环境下培养的细胞相比较，诸多生理指标都显著不同，例如原代小鼠乳腺管腔上皮细胞(mammary luminal epithelial cells, MEC)在3D基底膜基质中增殖的时间明显长于2D培养环境；更有甚者，有时药物作用于2D培养的细胞呈现的效应与3D细胞相反。3D培养可以设计模拟体内的生理环境，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近。正因为此，很多药物研发企业和护肤品生产企业更倾向于使用3D培养细胞（或组织类似物）来开展实验、研究：3D培养让药物研发企业相当程度上摆脱了伦理3R对动物实验的约束，缩短了研发周期，提高了结果可信度，研发少走了弯路，从而节省了成本，提高了企业的竞争力。可以预见，未来在高通量，自动化，低成本，广应用性和高预测性等方面3D培养将逐步突破并日趋成熟、完善，2D培养向3D的转变成为必然的发展趋势和时代潮流。
3D细胞培养的主要类型
当前市场上有多种类型的3D培养系统，根据产品是否为细胞提供支撑（支架）材料（scaffold）大体可分为两种类型：基于scaffold的培养体系和无scaffold的培养体系。Scaffold则又有天然成分和人工合成成分之分。
一、无scaffold的培养体系
没有供细胞粘附、生长和扩散的支撑结构，使培养基中的细胞聚集成为类似于组织的微组织球体（microtissue spheroids）。无scaffold的培养体系可通过悬滴（hanging drops）让细胞在重力的作用下通过自组装形成微球体。这种方法的优点是可以通过控制悬滴而精准的控制微组织球，使其具有高一致性，为后续研究提供好的微组织材料。而且通过悬滴法可以实现对不同细胞类型的共培养，保证共培养细胞间的信息交流。
无scaffold的培养悬滴培养体系的代表性厂家为InSphero，他们的96孔板设计可以通过手动操作，也支持自动化上样装置轻松实现微组织培养，在肿瘤研究和新型抗癌药物筛选等领域中被广泛选用。
下面对InSphero的悬滴培养技术做一简要介绍：
3D细胞培养板主要由GravityPlus板和GravityTRAP板组成，如下图：
GravityPlus 板：采用细胞悬滴法（专利技术），使细胞形成球体状微组织（3D状态）；将细胞悬液（一种细胞或多种细胞）添加到GravityPlus板中，2-4天，细胞在GravityPlus板中会形成微组织（微球状）；
GravityTRAP 板：采用非粘附包被技术，使微组织在无依附、不解聚情况下培养数周，便于后续实验及检测。当微组织形成后，将其转移到GravityTRAP板中，可使微组织在无依附、不解聚情况下培养数周，便于后续实验及检测。
InSphero无介质支架(scaffold-free) 培养形成的3D微组织呈多细胞球状体，无论在形态学上，还是在功能上均与自然组织类似。适用于标准的生物化学检测和免疫染色等处理。以便捷的96孔板内3D培养模式提供，在多种临床前检测中被广泛应用。紧密的细胞间连接，与体内类似的基因表达谱、营养和氧梯度等使3D微组织成为体外细胞实验的理想模式。
如今，全球最大的前15家制药和护肤品企业均在使用InSphero的GravityPLUS™平台及3D微组织。
另一代表性厂家是为N3D Biosciences，下面对N3D Biosciences的磁力驱动3D细胞培养做一简要介绍：
美国n3D Biosciences,Inc 以磁化细胞培养技术为基础，研发出一系列磁力驱动3D细胞培养产品。
磁化细胞培养技术：以NanoShuttle（一种生物相容性磁性纳米颗粒）为中心，将其加入到细胞或培养基中磁化细胞，然后再使用磁力驱动器，就可以让细胞进入磁悬浮状态或将细胞打印（printing）成具有结构和生物性能的典型3D模型（环状或微球状）。
对于96孔板试剂盒来说，磁力驱动器有两种：Dot磁力驱动器和Ring磁力驱动器，根据培养的细胞类型和应用来选择：
n3D Biosciences辅助产品：Magpen（磁力笔），可用于转移3D微组织或者是用于多细胞分层共培养
其它无scaffold产品还有：3D Biomatrix公司的Perfecta3D悬滴板通过悬滴技术实现微组织培养。InfiniteBio公司SCIVAX 3D产品，其NanoCulture Plate (NCP)为合成聚合物(synthetic polymer)材料，具有超低粘附力的微板结构表面，细胞在此微结构上迁徙、相互粘附形成微球体。BioLevitator应用磁性微球载体，整合3D和微载体培养技术实现高密度3D细胞培养；microtissues的3D petri Dish通过琼脂界面进行3D培养等。
二、基于scaffold的培养体系
1.根据支持物的性质分类，基于scaffold的培养体系可分为天然细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）作为支持材料的3D培养和人造基质作为支持材料的3D培养。
（1）天然ECM作为支持材料的3D培养
这种方法以天然ECM作为支持材料，根据培养细胞类型，优化3D培养基质配方，以满足不同组织细胞的培养需求。很多公司都可提供细胞外基质产品用于3D培养，例如TAP Biosystems（已被Sartorius Stedim Biotech收购）的RAFT胶原系统，Matrigel模拟基底膜基质产品；Advanced BioMatrix，Amsbio和Sigma-Aldrich公司也都有细胞外基质凝胶产品。但天然基质材料存在一定病原风险，且材料可能存在批次差别性等缺点。
（2）人造基质作为支持材料的3D培养方法
合成的人造基质材料类型相当多，例如Cellendes的3D Life仿生水凝胶材料；3D Biotek公司有多种3D大分子支架材料；Reinnervate公司Alvetex产品用的是聚苯乙烯(polystyrene scaffold)；Life Tech公司的AlgiMatrix 3D培养系统采用褐藻原料；Synthecon和Xanofi的纳米纤维技术平台XanoMatrix采用合成纳米生物基质和培养材料；PuraMatrix采用合成肽水凝胶；其它合成材料产品还包括Lena Biosciences的SeedEZ等。
Cellendes的3D Life仿生水凝胶材料可以说是合成的人造基质材料的优秀代表。Cellendes的3D Life仿生水凝胶通过合成大分子材料和交联剂(crosslinker)方式和比例的灵活组合，构建不同的3D细胞培养环境。这种高化学和机械柔性（flexibility）的合成系统赋予了该材料较动物源性支持材料更多的优势。诸多优点使3D Life仿生水凝胶不但是普通3D培养的上佳选项，也使其成为细胞扩散和迁移研究的理想产品。
下文对Cellendes的3D Life Biomimetic Hydrogel System做一简单介绍：
3D life仿生水凝胶系统与活体细胞外基质类似，可使体外细胞培养更接近体内的生理特征，是基础研究、药物筛选和再生医学等领域的理想选择。这类产品的优点主要体现在如下三个方面：A)产品组合灵活。B)操作简单，控制自如。C)应用范围广泛：可用于细胞培养、标记和显微观察等诸多方面；细胞可在凝胶内也可在凝胶表面培养；可活细胞直接观察也可选择原位固定后观察；支持GFP等多种报告基因标记后观察方式；可选择不同类型细胞共培养，更好模拟体内生理状态。
3D life主要有两种水凝胶：PEG-Link交联形成的水凝胶和CD-Link交联形成的水凝胶：
细胞在PEG-Link交联形成的水凝胶中培养
细胞可以通过单细胞或是细胞团的形式埋在PEG-Link为交联剂的水凝胶中，根据细胞类型不同，形成上皮样囊结构，微球体或是克隆。可以根据需要考虑为生成特定的表型而添加相应的细胞粘附因子。细胞不能在这种水凝胶中迁移扩散。
细胞在CD-Link交联形成的水凝胶中培养
细胞可以通过单细胞或是细胞团的形式埋在CD-Link为交联剂的水凝胶中，培养的细胞如产生相应的细胞外基质金属蛋白酶则能将临近的基质交联剂切割。在添加相应粘附因子基序下，细胞诱导细胞扩散和迁移。
3D life水凝胶中细胞的固定与标记
使用小分子物质，例如荧光标记phalloidin，核酸染料，活性和毒性检测试剂，增值检测试剂等小分子物质进行细胞标记方法，除了在孵育时间上适度延长以便能在水凝胶中充分扩散外，与传统的2D细胞培养方式相同。所培养的细胞如果经基因修饰还有荧光蛋白，则可直接用于观测，因凝胶完全透明不影响观测结果。如果使用抗体等大分子对细胞进行标记则不能直接在水凝胶中开展，因水凝胶的孔径原因，不适合直接抗体标记，需要使用dextranase将细胞从水凝胶中释放出来，如果担心细胞在操作过程中细胞生理活动波动，则可经在凝胶中将细胞固定后在进行操作。
2. 如果按支持材料形成的方式分，基于scaffold的培养体系可分为如下两类，一种是将细胞分散在液体水凝胶中，然后通过交联实现3D培养，这类产品代表生产商包括Cellendes, Matrigel, Glycosan Biosystems和QGel等；另外一种是将细胞“播种"在3D基质上，这类方法的代表厂商包括3D Biotek, Alvetex和AlgiMatrix等。第一种方式中的Cellendes产品上面已经做了简要介绍；下面将细胞“播种"在3D基质方法的代表产品3D Biotek给予简要介绍：
3D Biotek得益于其精妙的3D微细加工技术和先进的生物制造工艺，产品在干细胞/组织工程、药物研发和细胞生物应用等涉及3D培养的领域处于引领地位。
根据用户的不同需求，3D Biotek提供系列的产品和装置，包括多种3D细胞培养的支架材料：例如可生物降解的聚已内酯3D Insert PCL，这种材料已经被美国标准和技术协会(NIST)认定为标准的3D组织培养支架材料；聚苯乙烯3D Insert PS材料。
3D Biotek开发有独有的可直接用于如细胞凋亡和荧光ELISA等荧光和化学发光实验的新材料培养板。
3D Biotek还提供可降解生物材料Poly(DL-lactide-co-glycolide) (PDLLGA)。
3D Biotek有用于3D肿瘤细胞或干细胞培养(或共培养)的仿生基底膜：3D Insert-PS/PCL (聚苯乙烯/聚已内酯)纳米筛网。
高效将质粒转染入3D培养的细胞的3D转染试剂盒(BioCellChallenge, SAS)。
多种3D Biotek专利技术制造多孔聚合物支架材料填充的3D生物发生器（3D Bioreactor），即包括可生物降解聚合物(polystyrene, PS)也包括不能生物降解聚合物(polycaprolactone, PCL)类型。
各种预填充了孔状3D Insert™支架材料的塑料装置，如3D Insert™ PS (聚苯乙烯)支架，3D Insert™ PCL (聚已内酯)支架，3DKUBE™等。
用于骨组织工程中常用的可完全吸收的生物陶瓷材料B-TCP盘(Disc)，用于骨质疏松症，骨基质矿化，组织钙化和骨修复等各种骨相关研究的HA盘(Disc)等。
选用3D Biotek产品能获得高的细胞培养效率；增加细胞因子、抗体和其它生物分子的产出量，且生成的细胞因子、抗体等易于分离；减少动物实验，体外研究即可获高预测性资料，在开发新药中降低成本和时间，缩短进入市场的时间等优点。
三、微流体技术与3D培养
当前很多研究致力于将微工程学和微流体学与3D培养结合，开发灌流3D培养系统（perfused 3D culture systems）。动态灌流培养比静态培养系统更具优势，细胞能充分接触到营养物质和氧气。这类产品包括Provitro GmbH的灌流培养体系(Perfusion culture sys. PCS)，3D Biotek公司的3D Perfusion系统，Synthecon公司的旋转3D培养系统RCCS生物反应器，Zellwerk的Z RP (Red Point)培育平台；Gradientech的CellDirector产品则将细胞趋化与3D环境相结合起来。
下面选择Provitro GmbH灌流培养体系做简单介绍：
细胞单层培养技术最大限度降低了组织复杂性。但其缺点是缺少了细胞与基质之间的相互作用，从而导致细胞代谢和细胞表达呈现去分化状态。与单层细胞培养技术比较，3D培养下细胞可通过细胞外基质扩展，达到高浓度和营养供应状态。Provitro GmbH的3D培养通过自动化的灌流培养体系来满足3D培养所需要的更严格的细胞培养条件，在该体系下培养可保证稳定的营养浓度供应，稳定的pH值，并降低污染风险。
a)灌流培养体系：Provitro提供的灌流培养体系用显微镜可随时观察细胞培养状态，可保证整个灌流体系内细胞营养充足，没有培养死角；b)管状细胞灌流培养体系(Tube chamber system TCS)；c)流动灌流培养体系(Flow chamber system FCS)；d)灌流环路(Perfusion circuit)，包括灌流环路PCS3c (Perfusion circuit PCS3c)，灌流环路TCS2c (Perfusion circuit TCS2c)，灌流环路TCS1c (Perfusion circuit FCS1c)；e)根据用户的特殊需求定制的灌流培养体系(Customisation)
3D培养的缺点与局限
3D培养对药物研发和毒性测试意义重大，但当期也有一些问题尚待解决。包括：当前多数系统还不能模拟体内的生物机械动态特性；动物源或人源的支撑材料有一定病原风险，且这类材料可能存在批次差别性，在重复性上不及合成的支架材料。Scaffold培养方法在RNA、蛋白提取时需要注意，当然，当前已经开发了酶或是其它试剂在不损伤细胞条件下消化去除这类scaffold，另外，一些生化测定、图像扫描和荧光检测方面，scaffold是否存在影响，在选择产品时需要考虑到。总体上说，材料科学与生物学的结合使当前3D培养方式越来越多样化，用户的选择空间很大，可在比较中找到最适合自己的方法。众多的3D培养方法重点关注如何让3D体系更加接近人体实际环境，而对药物研发企业，他们除了模拟实际环境，还要求高效、自动化和可承受的使用成本。当前3D分析尚须实现飞跃，从而实现3D培养体系工业化应用便捷和高read-out。
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